同源重组法质粒构建在基因功能研究、蛋白表达及纯化等领域发挥着重要作用。此方法可应用于基因的敲除、敲低和过表达研究，帮助科学家探索基因功能、表达调控机制以及其对白细胞生理过程和表型的影响。通过优化启动子、核糖体结合位点等表达元件，并选择合适的宿主细胞，同源重组法能够有效构建表达载体，使目标蛋白在宿主细胞中达到高效表达以便后续的纯化。

与传统的酶切法不同，后者依赖于限制性内切酶的特异性切割，而同源重组法则基于DNA分子之间的同源序列进行重组。因此，以下将详细介绍同源重组法质粒构建的实验步骤。

实验流程

所需材料与仪器

实验所需材料包括：目标片段的cDNA、引物、载体、限制性内切酶、酶切缓冲液、LB培养基、LB培养基培养的细菌平板、同源重组酶、高保真酶、感受态细胞DH5α、胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、EP管、离心管、移液枪及枪头等。

实验步骤

同源重组法构建质粒的步骤如下：

1. 根据目标片段的酶切位点，选择合适的内切酶，使用双酶切法将环状载体质粒切割成线性载体。再通过琼脂糖凝胶法回收酶切产物，按照试剂盒说明操作。
2. 使用PCR法扩增目标片段序列，并同样通过琼脂糖凝胶法回收扩增产物。
3. 将线性载体与扩增的片段按比例连接，在37℃下反应30分钟或更长时间（1~2小时）。将连接好的重组质粒转入克隆感受态细胞DH5α中，轻轻吹打均匀后，在冰上静置30分钟，然后进行42°C水浴热激90秒，随后立即置于冰上冷却2~3分钟。
4. 加入500μl不含抗生素的LB液体培养基，37℃摇菌1小时，转速250rpm。
5. 将上一步的菌液以5000rpm离心5分钟，弃掉300μl上清液。将剩余培养基中的菌体重悬，最好按不同梯度涂板，以防细菌生长过密或过稀。用无菌涂布棒在含有质粒抗生素的平板上均匀涂布后，置于37℃培养箱培养10~12小时。
6. 过夜后，使用1μl枪头挑取单克隆菌，置于5ml含抗生素的LB液体培养基中，继续培养10~12小时。
7. 使用质粒小提试剂盒提取菌液中的重组质粒，并用限制性内切酶消化，然后进行琼脂糖电泳进行酶切鉴定。
8. 在第7步的同时，提取部分菌液进行菌液PCR，PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳以观察条带大小，从而进一步验证重组质粒的正确性。
9. 将确认合格的菌液送至测序公司进行双向测序，待比对结果确认无误后，表明重组质粒构建成功，可以进行后续实验。

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